篩選及應用拮抗細菌與植物萃取液防治芒果炭疽病

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論文名稱: 篩選及應用拮抗細菌與植物萃取液防治芒果炭疽病
研究生姓名: 劉冠霆
指導教授姓名: 李敏惠
出版年: 2015
學校名稱: 國立中興大學
系所名稱: 植物病理學系所
關鍵字: 芒果炭疽病、Colletotrichum gloeosporioides、生物防治、植物萃取液
摘要: 芒果為台灣重要的外銷出口作物,位居果品出口總產值第一,而炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides Penz.為芒果栽培之最重要病原菌,可以感染芒果樹的葉、花穗、枝條及採收前與採收後果實,並造成產量及品質嚴重受損。目前以套袋及化學藥劑噴灑為主要防治方式,然而後者所衍生的病原菌抗藥性及藥劑殘留過量等問題亦相應而生,本研究透過微生物源與植物源資材的篩選與運用,提供防治芒果炭疽病的參考。由於芒果果實一年一穫,因此以芒果切離葉片作為分析之材料。為建立切離葉接種平台的穩定性,進行不同葉齡葉片接種,結果顯示8天內之葉齡發病穩定。葉表與葉背在接種後24小時,孢子發芽率與附著器生成率並無顯著差異。利用乙醇萃取17種植物材料,發現其中4種萃取液對C. gloeosporioides TYC-2菌絲生長抑制率將近50%。植物A乙醇萃取液於濃度0.08 mg/ml下可完全抑制孢子發芽。將植物A乙醇萃取液與TYC-2孢子同時接種至果實上,分別於0.08 mg/ml下可完全抑制病害發生。自土壤、芒果葉片及芒果花中分離出45株酵母菌及83株細菌具有抑制TYC-2菌絲生長能力。酵母菌分離株中,3H-4菌株於PDA培養基上與TYC-2菌株共培養後,具有優異之競爭能力;於細菌分離株中,菌株A與菌株B對於15株不同寄主來源之炭疽病菌亦具有抑制效果,經由16S rDNA以及Biolog鑑定後,皆為Bacillus amyloliquefaciens。經由切離葉與果實接種試驗發現菌株A與菌株B於培養液 (SSM) 4天之發酵液經稀釋100倍後,可抑制病斑之產生,並且於切離葉接種試驗中發現菌株B於稀釋600倍後仍具有80%之病斑面積抑制效果。將菌株B之SSM發酵液靜置於室溫下20週,其菌量可由1.48 × 109cfu/ml上升至2.6 × 109cfu/ml;經由100℃處理菌株B之SSM發酵濾液20分鐘,其抑菌能力並無降低的現象。為了促進菌株B發酵液之抑病能力,因而添加不同植物油於SSM培養液中,在SSM中添加0.5%植物油A稀釋200倍後,可提升菌株B發酵液之病斑面積抑制率由43%至100%。經由切離葉接種分析,發現菌株B SSM發酵液之有效成分為發酵濾液,將發酵濾液與TYC-2孢子於玻片上共培養後,發現其具有抑制發芽並造成發芽管不正常膨脹的能力。經由掃描式電子顯微鏡觀察,芒果葉片上菌株B SSM發酵液可使TYC-2發芽管形態異常。在果實上則顯示菌株B SSM發酵液處理32小時後,菌絲產生許多空泡結構,並於接種後72小時仍無法觀察到果表壞疽病斑的產生,而對照組於接種48小時後即產生顯微壞疽病斑。利用薄層色層分析法分析菌株B於SSM與SSM添加0.5%植物油A之酸沉降萃取液,皆可發現Rf值0.045與Rf值0.38具有抗生活性,將此兩區間之TLC活性回收液與酸沉降萃取液進一步使用高效液相層析法分析,皆可發現於Rf值0.38之TLC活性回收液具有與iturin A標準品相同滯留時間的波峰,此外,兩發酵液之酸沉降萃取液皆可發現與iturin A標準品及surfactin標準品相似滯留時間的波峰。綜合上述結果,植物A乙醇萃取液與B. amyloliquefaciens 菌株B具有進一步發展為田間應用的生物防治藥劑潛力。
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